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產(chǎn)品中心

  • 耐萬古霉素腸球菌vanAvanB雙重探針法qPCR試劑盒

    規(guī)格:
    • 品牌 : 通蔚生物
    • 目錄號 : TW-E10629
    • 應(yīng)用 : 僅限于科研使用
    • 貨期 : 2年
    • 規(guī)格 :50T
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產(chǎn)品及特點

耐萬古霉素腸球菌(Vancomycin-Resistant Enterococcus,VRE)又名萬古霉素抗藥性腸球菌,是腸球菌屬下的一種細(xì)菌,有著對萬古霉素這種抗生素的抗藥性。腸球菌是一種移生在腸道的革蘭氏陽性球菌,故名腸球菌。在十九世紀(jì)末發(fā)現(xiàn),早期歸為鏈球菌屬。在腸球菌屬中,對人類有著病原性的有糞腸球菌(Enterococcus faecalis)及屎腸球菌(Enterococcus faecium)。而所有屎腸球菌更是有著抗藥性的,亦即所有屎腸球菌都是VRE。腸球菌屬的細(xì)菌主要是在腸內(nèi),亦可以在人類的消化道及尿道內(nèi)發(fā)現(xiàn)。VRE特別對免疫系統(tǒng)受損的人有危險性,但是它令健康的人受感染則較少見。一般來說可以引起心內(nèi)膜炎、敗血病及尿道感染等病癥。雖然相信有很大比例的雞只帶有VRE,但常見出現(xiàn)接觸的地方仍是在醫(yī)院(院內(nèi)感染)。因此快速檢測耐萬古霉素腸球菌vanA/vanB具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以探針法qPCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測耐萬古霉素腸球菌vanA/vanB的試劑盒,它具有下列特點:

1. 即開即用,用戶只需要提供樣品DNA模板。
2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,分析靈敏性高,可以達(dá)到100拷貝/反應(yīng)。
3.提供陽性對照,便于區(qū)分假陰性樣品。
4.特異性高,引物是根據(jù)耐萬古霉素腸球菌vanA/vanB DNA高度保守區(qū)設(shè)計,不會跟其他生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5.既可用于定性檢測,又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級。
6.兩個探針分別用FAM和HEX標(biāo)記,檢測和分型同時完成。
7.本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng)。
8. 產(chǎn)品只能用于科研。

規(guī)格及成分

成分

規(guī)格

包裝

2×Probe qPCR MasterMix

0.5mL

0.5mL本色

熒光PCR專用模板稀釋液

1mL

1.5mL綠蓋管

耐萬古霉素腸球菌vanA/vanB qPCR引物-探針干粉

50次

1.5mL棕色管

耐萬古霉素腸球菌vanA qPCR陽性對照(1×10E7拷貝/μL)

50μL

0.5mL黃蓋管

耐萬古霉素腸球菌vanB qPCR陽性對照(1×10E7拷貝/μL)

50μL

0.5mL白蓋管

使用手冊

1份

本產(chǎn)品采用五孔盒包裝

意:引物-探針干粉在使用前需要短暫離心,然后在離心管中加入162uL的超純水充分混勻后再使用,未用完的需要-20℃保存。


使用方法

稀釋耐萬古霉素腸球菌vanA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品 以陽性對照10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。
1. 標(biāo)記6個離心管,分別為A6,A5,A4,A3,A2,A1。
2. 在A1-A6號管中各加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液。
3. 在A6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線PC樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭,在A5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭,在A4號管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用
6. 重復(fù)上面的操作得到A1-A6共六個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線陽性樣品。放冰上待用。

稀釋耐萬古霉素腸球菌vanB檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品
7. 操作同上,只是使用耐萬古霉素腸球菌vanB的PC作為模板。得到6個濃度的樣本放冰上待用,分別是B1-B6。
樣品DNA的制備
8. 如果有N個樣品,設(shè)置N+3個提取,多出的一個是耐萬古霉素腸球菌vanA的PC(樣品制備陽性對照),一個是耐萬古霉素腸球菌vanB的PC(樣品制備陽性對照),一個是NC(樣品制備陰性對照)??梢杂?0μL第一步和第二步所得的4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟樣本制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣,以此分別作為兩個PC。另外用水作為NC,水的總體積需要跟樣本制備試劑盒所要求的樣本體積一樣。
9. 用自選方法純化樣品的DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)樣品DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qPCR反應(yīng)20μL體系,在樣品制備室進(jìn)行
10. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+3+1+6+6個PCR管,其中N+3個用于上步得到的N+3個樣品,1個用于PCR陰性對照(用水做模板),6個用于耐萬古霉素腸球菌vanA的標(biāo)準(zhǔn)曲線,另外6個用于耐萬古霉素腸球菌vanB的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+3+3個PCR管,其中N+3個用于上步得到的N+3個樣品,1個用于PCR陰性對照(用水做模板),1個用于耐萬古霉素腸球菌vanA PCR陽性對照,1個用于耐萬古霉素腸球菌vanB PCR陽性對照(直接用第一步和第二步所得的兩個4號稀釋液作為模板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

數(shù)據(jù)處理
1. 如果擴增陽性對照或制備陽性對照結(jié)果為陰性,則整個擴增或制備實驗無效,不需要分析數(shù)據(jù),需要重做擴增或制備或跟廠家聯(lián)系。如果擴增陰性對照或制備陰性對照結(jié)果為陽性,說明環(huán)境污染,則整個擴增或制備實驗無效,不需要分析數(shù)據(jù),需要跟廠家聯(lián)系,購買新的引物和探針。
2. 如果陰性對照和陽性對照正常,則實驗有效,可以進(jìn)入后續(xù)分析。
3. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的log值為橫軸,分別以陽性對照(FAM通道)和(HEX通道)的Ct值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,陽性對照的標(biāo)準(zhǔn)曲線為斜線,r2必須大于0.95。再以待測樣品的Ct值從陽性對照的標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,再推算出其濃度。
4. 對定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照的Ct必須大于35,或者沒有Ct值。陽性對照的熒光信號必須有對數(shù)增長,有典型擴增曲線,Ct值應(yīng)該小于35。對待測樣品,如果其FAM通道的Ct大于35則為耐萬古霉素腸球菌vanA陰性,如果小于或等于35則為耐萬古霉素腸球菌vanA陽性。如果其HEX通道的Ct大于35則為耐萬古霉素腸球菌vanB陰性

自備試劑
樣品DNA
運輸及保存
低溫運輸,-20℃保存,有效期2年
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