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嗜肺巴斯德桿菌探針法qPCR試劑盒(含內(nèi)參)
產(chǎn)品及特點
嗜肺巴斯德桿菌（Pasteurella pneumotropica）屬于巴斯德菌科，是巴斯德菌屬中的一種革蘭氏陰性、無動力、無芽孢的短桿或球桿菌。嗜肺巴斯德桿菌是一種條件致病菌，廣泛分布于自然界，尤其容易感染嚙齒類動物，如小鼠、大鼠和豚鼠。在國內(nèi)外的實驗動物中，它是目前已知感染率高的病原菌之一。此外，嗜肺巴斯德桿菌還是人獸共患病原，能夠致使免疫缺陷或免疫功能低下的動物發(fā)病，同時也可能引發(fā)人類的局部以及全身感染?？梢?，嗜肺巴斯德桿菌作為一種重要的人獸共患病原菌，對實驗動物和人類健康均可能帶來嚴(yán)重威脅。因此快速檢測嗜肺巴斯德桿菌具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以探針法qPCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測嗜肺巴斯德桿菌的試劑盒，它具有下列特點：
嗜肺巴斯德桿菌（Pasteurella pneumotropica）屬于巴斯德菌科，是巴斯德菌屬中的一種革蘭氏陰性、無動力、無芽孢的短桿或球桿菌。嗜肺巴斯德桿菌是一種條件致病菌，廣泛分布于自然界，尤其容易感染嚙齒類動物，如小鼠、大鼠和豚鼠。在國內(nèi)外的實驗動物中，它是目前已知感染率高的病原菌之一。此外，嗜肺巴斯德桿菌還是人獸共患病原，能夠致使免疫缺陷或免疫功能低下的動物發(fā)病，同時也可能引發(fā)人類的局部以及全身感染?？梢?，嗜肺巴斯德桿菌作為一種重要的人獸共患病原菌，對實驗動物和人類健康均可能帶來嚴(yán)重威脅。因此快速檢測嗜肺巴斯德桿菌具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以探針法qPCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測嗜肺巴斯德桿菌的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到100拷貝/反應(yīng)。
3. 提供陽性對照，便于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線和用作擴(kuò)增對照，排除假陰性結(jié)果。
4. 識別內(nèi)源性內(nèi)參的引物和探針，便于排除PCR假陰性樣本。
5. 特異性高，靶分子的引物和探針是根據(jù)嗜肺巴斯德桿菌DNA高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
6. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級。
7. 本產(chǎn)品足夠50次20 μL體系的探針法qPCR反應(yīng)。
8. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
500μL |
0.5mL本色管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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超純水 |
1mL |
1.5mL藍(lán)蓋管 |
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嗜肺巴斯德桿菌qPCR引物-探針干粉(含內(nèi)參引物探針) |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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嗜肺巴斯德桿菌qPCR陽性對照(1E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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使用手冊 |
1份 |
無 |
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入220 μL超純水充分混勻后得到引物-探針混合液再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記6個離心管，分別為6、5、4、3、2、1。
2. 在各管中加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液。
3. 在6號管中加入5 μL 1E7拷貝/μL的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1E6拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1E5拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線陽性樣品。放冰上待用。
樣品DNA的制備
7. 如果有N個樣品，設(shè)置N+2個提取，多出的一個是制備PC（樣品制備陽性對照），一個是制備NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂么_認(rèn)是陽性的樣本作為陽性對照，用確認(rèn)是陰性的樣本作為陰性對照。
8. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)DNA提取試劑盒兼容，也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qPCR反應(yīng)20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 陰性陽性判斷：沒有Ct讀數(shù)，或Ct大于40判為陰性結(jié)果。有Ct讀數(shù)，Ct值小于40，熒光信號有對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線判為陽性結(jié)果。每個樣本需要對FAM通道和Cy5通道的結(jié)果分別進(jìn)行判定，得到兩個結(jié)果。
2. 實驗有效性判斷：如果擴(kuò)增陽性對照或制備陽性對照FAM通道結(jié)果為陰性則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要分析原因，可能是操作、儀器和試劑三方面的原因，重做擴(kuò)增或制備或跟儀器和試劑廠家聯(lián)系。如果擴(kuò)增陰性對照或制備陰性對照FAM通道結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要分析失敗原因，直到污染消除。如果陽性對照和陰性對照正常，則進(jìn)入下一步分析樣本的有效性。
3. 樣本有效性判斷：如果樣本FAM通道的結(jié)果為陽性，則無論內(nèi)參Cy5通道的結(jié)果是陰性還是陽性，樣本的結(jié)果均有效。如果樣本結(jié)果為陰性，內(nèi)參通道結(jié)果也為陰性，則此樣品的陰性結(jié)果無效。此樣品需要重新提取核酸和進(jìn)行擴(kuò)增。
4. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，分別以陽性對照FAM通道和內(nèi)參Cy5通道的Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，陽性對照FAM通道讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為斜線，r2必須大于0.95，內(nèi)參Cy5通道讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為一條跟X軸平行的橫線。再以待測樣品的Ct值從陽性對照FAM通道讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
5. 如果用于定性實驗，對待測樣品，如果其FAM通道的Ct沒有讀數(shù)、或Ct大于或等于40則均為陰性，如果小于40則為陽性。對任何FAM通道結(jié)果為陰性的待測樣本，如果其對應(yīng)的內(nèi)參Cy5通道也為陰性，則此樣品的陰性結(jié)果無效，此樣品需要重復(fù)實驗。
自備試劑
樣品DNA
樣品DNA
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
