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最新產(chǎn)品

  • 小鼠Flag標(biāo)簽(Flag-tag)ELISA試劑盒

    規(guī)格:
    價(jià)格:
    • 品牌 : 通蔚生物
    • 目錄號(hào) : TW7409
    • 應(yīng)用 : 僅限于科研使用
    • 英文名 :Mouse Flag-tag ELISA KIT
    • 貨期 : 現(xiàn)貨
    • 靈敏度 :0.06ng/mL
    • 規(guī)格 :48T/96T
    • 檢測(cè)范圍 :0.125 ~ 8ng/ml
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簡(jiǎn)介
FLAG標(biāo)簽,或FLAG八肽,或FLAG表位,是一種多肽蛋白質(zhì)標(biāo)簽,可以用重組DNA技術(shù)添加到蛋白質(zhì)中,其序列圖案為DYKDDDDK(其中D=天冬氨酸,Y=酪氨酸,K=賴(lài)氨酸),它是最特異的標(biāo)簽之一,是一種通用種屬工抗原,已經(jīng)開(kāi)發(fā)出特異的、高親和力的單克隆抗體,因此可用于親和層析法的蛋白質(zhì)純化,也可用于定位活細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì),它已被用于分離重組的、過(guò)量表達(dá)的蛋白和宿主生物體表達(dá)的野生型蛋白,它還可用于分離具有多個(gè)亞單位的蛋白質(zhì)復(fù)合物,因?yàn)槠錅睾偷募兓^(guò)程往往不會(huì)破壞這種復(fù)合物,它已被用于獲得足夠純度和質(zhì)量的蛋白質(zhì),以通過(guò)X射線晶體學(xué)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)測(cè)定,F(xiàn)LAG標(biāo)簽可用于許多需要抗體識(shí)別的不同檢測(cè)中,如果沒(méi)有針對(duì)某一特定蛋白的抗體,在蛋白上添加FLAG標(biāo)記,就可以用針對(duì)FLAG序列的抗體來(lái)研究該蛋白,例如通過(guò)免疫熒光、免疫沉淀或通過(guò)SDS PAGE蛋白電泳和Western印跡檢測(cè)進(jìn)行細(xì)胞定位研究,從N端到C端的FLAG標(biāo)簽的肽序列是,DYKDDDDK(1012Da),此外,它還可以串聯(lián)使用,常見(jiàn)的是3xFLAG肽,DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK(最后一個(gè)標(biāo)簽編碼一個(gè)腸激酶裂解位點(diǎn)),它可以與蛋白質(zhì)的C端或N端融合,或插入到蛋白質(zhì)內(nèi),一些市售的抗體(如 M1/4E11)只有在N端出現(xiàn)時(shí)才能識(shí)別該表位,然而,其他可用的抗體(如M2)則對(duì)位置不敏感,F(xiàn)LAG標(biāo)簽中的酪氨酸殘基可以被硫酸化,這可能會(huì)影響抗體對(duì)FLAG表位的識(shí)別,F(xiàn)LAG標(biāo)簽可以與其他親和力標(biāo)簽一起使用,例如多組氨酸標(biāo)簽(His標(biāo)簽)、HA標(biāo)簽或myc標(biāo)簽。
檢測(cè)原理
本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù):將捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上,捕獲樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中的待測(cè)物Flag-tag,清洗后,再加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體進(jìn)行孵育后清洗,形成“捕獲抗體-抗原-檢測(cè)抗體”免疫復(fù)合物,隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行孵育,待孵育結(jié)束后清洗,接著加入TMB顯色后,若樣本中有待測(cè)物則顯藍(lán)色,加入終止液停止反應(yīng)。檢測(cè)過(guò)程中游離的成分均被洗去,用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)OD值,顏色的深淺和樣品中的待測(cè)物的含量呈正比,通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中Flag-tag的濃度。
需要的其他材料
1.  酶標(biāo)儀,包含450nm測(cè)定波長(zhǎng),同時(shí)包含600-680nm校正波長(zhǎng)更佳;
2.  移液器及槍頭;
3.  蒸餾水或去離子水;
4.  100-1000 mL刻度量筒;
5.  洗瓶、排槍或自動(dòng)微孔板清洗機(jī);
6.  水平軌道微孔板振蕩器,能夠保持500±50 rpm的速度;
7.  用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。
樣品保存
樣品收集后若在 1 周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃,若不能及時(shí)檢測(cè),請(qǐng)按一次使用量分裝,凍存于-20℃(1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)),或-80℃(6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)),避免反復(fù)凍融,標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
試劑準(zhǔn)備工作
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液(20×)有晶體析出,需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋?zhuān)ɡ纾?mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水)
標(biāo)準(zhǔn)品配置

試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品,準(zhǔn)備7個(gè)試管,先從160ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品(200μL)按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至8ng/mL(例:50μL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+950μL的1×稀釋液,制備得到1000μL的8ng/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)品),隨后在6個(gè)試管中分別加入500μL的1×稀釋液,在這6個(gè)單獨(dú)的試管中將8ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品依次2倍倍比稀釋至6個(gè)梯度,共配制7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,依次為: 8ng/mL、 4ng/mL、 2ng/mL、 1ng/mL、 0.5ng/mL、 0.25ng/mL、 0.125ng/mL,從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取500μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個(gè)試管中,輕輕吹打混勻,以此類(lèi)推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋?zhuān)ㄈ鐖D所示),1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0ng/mL)。

小鼠(Flag-tag) ELISA試劑盒

抗體工作液配置
使用前10分鐘,將100×生物素化抗體于1000×g離心1分鐘,隨后用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液,根據(jù)所需用量當(dāng)日配置當(dāng)日使用。
酶結(jié)合物工作液配置
使用前10分鐘,將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘,隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液,根據(jù)所需用量配置。
備 注:如待測(cè)樣本中Flag-tag濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值,請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。
結(jié)果的計(jì)算
計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時(shí)去掉空白組的值)?;蛘呤褂媚軌蛏伤膮?shù)邏輯(4-P)曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件來(lái)創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
示例數(shù)據(jù)

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考,實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/mL)

8

4

2

1

0.5

0.25

0.125

0

OD值

2.553

1.616

1.08

0.653

0.385

0.269

0.189

0.061

校正OD值

2.492

1.555

1.019

0.592

0.324

0.208

0.128

0








下圖所示標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供示例,結(jié)果計(jì)算應(yīng)以同次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線為準(zhǔn)計(jì)算樣本結(jié)果

小鼠(Flag-tag) ELISA試劑盒

重復(fù)性
板內(nèi)變異系數(shù)小于10%,板間變異系數(shù)小于10%。
靈敏度
經(jīng)樣本測(cè)試,本試劑盒的檢測(cè)靈敏度為0.06ng/mL。
特異性
該試劑盒測(cè)定可識(shí)別重組小鼠Flag-tag。
其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL,并測(cè)定交叉反應(yīng)性。沒(méi)有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。
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