當(dāng)您進(jìn)行組織樣本的ELISA實驗時，蛋白濃度的均一性是非常關(guān)鍵的，因為蛋白濃度的差異可能導(dǎo)致結(jié)果的不一致性。因此，確實需要對每個樣品進(jìn)行蛋白定量以確保各樣品有相同或已知的蛋白濃度。今天，通蔚給大家介紹一下elisa如何定量蛋白濃度，在開始之前，我們先知道elisa測定生物樣品中目標(biāo)蛋白的濃度的三種類型：
  
  定量：可以通過系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的OD值和相應(yīng)的已知濃度來生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的 ELISA 數(shù)據(jù)可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線插值來計算樣品中目標(biāo)蛋白的濃度。
  
  定性：我們簡單地從檢測中得到陰性或陽性結(jié)果，通過與陰性對照比較來確定某個樣品中是否存在任何目標(biāo)蛋白。
  
  半定量：使用這種類型的ELISA 試劑盒，我們可以獲得陰性或陽性結(jié)果，并比較檢測樣品中的目標(biāo)蛋白水平，因為樣品的吸光度水平將直接對應(yīng)于目標(biāo)蛋白的水平專注。然而，由于試劑盒中沒有任何標(biāo)準(zhǔn)蛋白，我們無法計算出準(zhǔn)確的濃度。
  
  一般來說，使用定量ELISA試劑盒，您可以對樣品中的目標(biāo)蛋白進(jìn)行定量，因為您測試了一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。當(dāng)您使用定量 ELISA 試劑盒分析 ELISA 數(shù)據(jù)時，您必須繪制平均吸光度與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系，并繪制最適合您的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果的曲線，然后將樣品的吸光度插入曲線以計算濃度。該 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線實驗方案將為您提供有關(guān)如何使用定量 ELISA 試劑盒逐步計算 ELISA 結(jié)果的全面說明。
  
  關(guān)于樣品中目標(biāo)蛋白的濃度，向您推薦一款使用簡單的ELISA數(shù)據(jù)分析軟件Curve Expert 1.4。市場上還有許多其他曲線擬合軟件可以進(jìn)行 ELISA 計算，例如GraphPad Prism，或者您也可以使用普通的 MS Excel 進(jìn)行分析。
  
  一、如何使用Curve Expert繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算目標(biāo)蛋白濃度？
  
  處理 ELISA 數(shù)據(jù)分析分為三個步驟：
  
  1、將標(biāo)準(zhǔn)品的ELISA數(shù)據(jù)輸入軟件
  
  2、選擇最佳擬合曲線
  
  3、通過插值計算目標(biāo)蛋白的濃度
  
  現(xiàn)在我將一步步向您展示如何制作ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
  
  1. 將標(biāo)準(zhǔn)品的ELISA數(shù)據(jù)輸入軟件
  
  進(jìn)行 ELISA 測定后，您可以將原始數(shù)據(jù)分為三個部分。建議運行一式兩份或一式三份的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。作為zui佳實踐，您最好將重復(fù)的 CV 控制在 8% 以下。
  
  第1部分：已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度
  
  第 2 部分：空白孔/背景的吸光度
  
  第3部分：未知濃度樣品的吸光度
  
  標(biāo)準(zhǔn)品用樣品稀釋劑連續(xù)稀釋。樣品可能還需要稀釋。由于即使在檢測波長處不存在蛋白質(zhì)，樣品稀釋劑也具有吸光度，因此我們在測定中使用樣品稀釋劑進(jìn)行空白實驗以獲得背景 OD。通常的做法是從標(biāo)準(zhǔn)品和所有樣品的吸光度中減去空白孔的吸光度。
  
  這里我們以“Curve Expert 1.4”為例，向您展示如何操作該軟件并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
  
  1.1啟動“Curve Expert 1.4”。您可以看到下面的界面。

  該軟件可以輕松定位 x/y 點、微分以及通過從繪圖菜單中選擇“分析”或按 Ctrl-L 執(zhí)行的曲線擬合積分。在此示例中，我們希望通過評估給定 OD（X 值）下的曲線擬合來找到目標(biāo)蛋白的濃度（Y 值）。只需在“At X=”字段中輸入要評估曲線擬合的點（x 值），然后按鍵盤上的[ Calculate ] 或 [ Enter ]。然后計算器將顯示相應(yīng)的 y 值。

  系數(shù)部分給出當(dāng)前模型的相關(guān)參數(shù)值——這些系數(shù)始終表示為 a、b、c、d 等。這些系數(shù)與模型部分中顯示的模型相匹配。如果系數(shù)列表超出了它們顯示的窗口范圍，則會出現(xiàn)一個滾動條，允許您滾動瀏覽參數(shù)。

  將X(OD)、a、b、c、d值分別帶入公式中，然后按鍵盤上的[ Enter ]鍵即可計算出濃度。為了得到最準(zhǔn)確的結(jié)果，建議預(yù)先確定合適的稀釋倍數(shù)，確保稀釋后樣品中目標(biāo)蛋白的濃度落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。如果樣品已被稀釋，則計算時應(yīng)考慮稀釋因子。

  標(biāo)準(zhǔn)曲線對于準(zhǔn)確分析 ELISA 結(jié)果非常重要。因此，您應(yīng)該在每次測定中運行標(biāo)準(zhǔn)品，以避免由于每次測定的操作員、移液、孵育和溫度的差異而導(dǎo)致系統(tǒng)偏差。

  上述是以人TNF-α ELISA試劑盒為例通過Curve Expert繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算目標(biāo)蛋白濃度，大家可以參考。Curve Expert軟件可能是一個收費的軟件，您可以通過Excel或其他軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，或者您可以將您的數(shù)據(jù)發(fā)送給我們，我們將為您處理數(shù)據(jù)。如果還有不明白的可以咨詢我們專業(yè)的elisa試劑盒顧問尋求免費解答！在這里通蔚祝您實驗順利！